С целью выяснения субклеточного механизма развития недостаточности сердца при воспалительных повреждениях миокарда был изучен транспорт Са²⁺ мембранами кардиомиоцита кроликов при токсико-аллергическом миокардите (ТАМ). Было установлено, что одновременно с падением способности системы контрактильных белков миокарда генерировать силу и производить работу и развитием энергетического дефицита происходит значительное снижение способности саркоплазматичнского ретикулума (СР)  миокарда связывать, поглощать и высвобождать Са^{2+ 1}.

Известно, что регуляция функционирования  Са²⁺-насоса СР в миокарде осуществляется цАМФ- и Са²⁺-кальмодулин-зависимыми протеинкиназами ², которые сопряжено фосфорилируя фосфоламбан, устраняют его ингибиторное действие на Са²⁺-насос и тем самым активируют поглощение Са²⁺ СР ^3,4. Имеются данные о фосфорилировании указанными протеинкиназами и рианодинового рецептора (основной белковый компонент Са²⁺ -освобождающего канала СР), однако участие этого процесса в механизме освобождения Са²⁺  из СР все еще остается неясным ^5,6.

В настоящей работе исследовано влияние Са²⁺-кальмодулин- и цАМФ-зависимого фосфорилирования СР на поглощение Са²⁺  при ТАМ.

Материал и методы: Работа проведена на 53 кроликах породы шиншилла массой 2,5-3,0 кг. Из них 28 кроликов были практически здоровыми – нормальные (16 кроликов составили группу контрольных животных, сердца 12 кроликов были использованы для получения фосфоламбана),  25 – с ТАМ 10-ти дневной продолжительности, который воспроизводили по методу С.В. Андреева и М.В. Соколова ⁷. Суммарный препарат СР выделяли по методу  Harigaya S., Schwartz А. ⁸. Дальнейшее фракционирование препарата проводили путем частичного насыщения везикул СР оксалатом Са²⁺ и центрифугирования в ступенчатом градиенте плотности сахарозы. суммарную фракцию СР разделяли на кофеин-чувствительную субфракцию, содержащую систему Са²⁺-зависимого освобождения Са²⁺ («контактный» СР) и субфракцию «свободного» СР, осуществляющего реаккумуляцию Са^{2+ 9,10}. Стандартная инкубационная среда для определения поглощения  Са²⁺ содержала  20mM трис-малеатный буфер  (pH 6,8), 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 2 mM двунатриевую соль ATФ, 5 mM  оксалат калия и мембранный белок в концентрации 20-70 мг/мл. Реакцию начинали добавлением 50 или 100 мкM ^[45]CaCl₂ после прединкубационного периода (1 мин). Частично очищенный фосфоламбан в комплексе с Са²⁺ -кальмодулин-зависимой протеинкиназой получали так же из суммарного препарата СР миокарда нормальных кроликов по методу Jones L.R. et al. ¹¹. Фосфорилирование суммарного препарата СР и фосфорилирование фосфоламбана эндогенной Са²⁺-кальмодулин-зависимой протеинкиназой и экзогенной цАМФ-зависимой протеинкиназой проводили по методу Seiler S. et al. с использованием [g-³²P] АТФ и техники миллипоровой фильтрации ⁵. Радиоактивность проб определяли на жидкостно-сцинтилляционном счетчике Дельта-300 (“Searle”, Голландия). Данные обработаны статистически с использованием критерия t Стьюдента и программ STAT Soft.

Результаты и их обсуждение:  Показано, что в присутствии экзогенноного кальмодулина уровень фосфорилирования СР нормального миокарда повышается на 63%, а в присутствии экзогенной цАМФ-зависимой протеинкиназы – на 55%. Их совместное действие ведет к увеличению фосфорилирования на 137% (табл. 1). При этом внесение в среду инкубации кальмодулина активирует уровень поглощения Са²⁺ СР на 55%, цАМФ-зависимой протеинкиназы – на 74%, а совместное воздействие кальмодулина и цАМФ-зависимой протеинкиназы дает аддитивный эффект – поглощение Са²⁺  возрастает на 145% (табл. 2).

При Там внесение кальмодулина и цАМФ-зависимой протеинкиназы (в отдельности и совместно), в отличие от нормы, не вызывает активации ни процесса фосфорилирования (табл.1), ни транспорта Са²⁺  СР (табл. 2).

 Таблица  1.

Са²⁺-кальмодулин- и цАМФ-зависимое фосфорилирование СР (нмоль P_н/мг белка)

Примечание: ^* - сравнение с контролем;   ⁺ - сравнение с базальным уровнем; один знак –  p< 0,05; два –  < 0,01; три – < 0,001

Таблица 2.

Са²⁺-кальмодулин- и цАМФ-зависимое поглощение Са²⁺ СР (нмоль Са²⁺/мг белка)

Примечание: обозначения те же, что и в табл. 1.

Кофеин и термостабильный белок-ингибитор цАМФ-зависимой протеинкиназы в присутствии ЭГТА существенно не изменяют уровень фосфорилирования «контактного» СР ни в норме, ни при ТАМ. В то же время в норме кальмодулин в присутствии Са²⁺  значительно, в  2  раза стимулирует фосфорилирование «контактного» СР. Этот стимулирующий эффект полностью снимается кофеином. В отличие от кальмодулина, экзогенная цАМФ-зависимая протеинкиназа на уровень фосфорилирования «контактного» СР влияния не оказывает (табл. 3).

При ТАМ кальмодулин почти в такой же степени, что и в норме (в 2,1 раза) активирует фосфорилирование «контактного» СР, а кофеин также снимает этот эффект. Отсутствие действия цАМФ-зависимой протеинкиназы имеет место и при кардиомиопатии, обусловленной ТАМ (табл.3).

В «свободном» СР кофеин и белок-ингибитор цАМФ-зависимой протеинкиназы также, как и в «контактном» СР, не оказывают воздействия на базальный уровень фосфорилирования (немного превышающий базальный уровень фосфорилирования суммарной фракции СР). Однако, в отличие от «контактного» СР, добавление кальмодулина в контроле в инкубационную среду не ведет к стимуляции процесса фосфорилирования, тогда как цАМФ-зависимая протеинкиназа в 1,8 раза повышает его. Этот стимулирующий эффект снимается как белком-ингибитором цАМФ-зависимой протеинкиназы, так и кофеином (табл.3).

 Базальный уровень фосфорилирования комплекса фосфоламбана с эндогенной Са²⁺-кальмодулин-зависимой протеинкиназой в 2,4 раза превышает базальный уровень фосфорилирования суммарной фракции СР. В то же время фосфоламбан СР миокарда нормальных кроликов в этом комплексе способен в весьма значительной степени фосфорилироваться как кальмодулином (процесс возрастает в 8,3 раза), так и экзогенной цАМФ-зависимой протеинкиназой (возрастает в 8,5 раза). Однако фосфоламбан, выделенный из сердец кроликов с ТАМ, как и суммарный препарат СР, теряет

способность фосфорилироваться  как под воздействием кальмодулина, так и цАМФ-зависимой протеинкиназы. Более того, при ТАМ в 3,2 раза снижается базальный уровень фосфорилирования фосфоламбана  (табл. 4).

Таблица 4.

Са²⁺-кальмодулин- и цАМФ-зависимое фосфорилирование фосфоламбана, нмоль Ф_н/мг белка

Примечание: обозначения те же, что и в табл. 1.

 Полученные результаты  подтверждают данные, что кальмодулин- и цАМФ-зависимые протеинкиназы свое стимулирующее действие на активный транспорт Са²⁺  СР сердца оказывают путем фосфорилирования  разных  участков  фосфоламбана,  один  из  которых  фосфорилируется Са²⁺-кальмодулин-зависимой протеинкиназой, ассоциированной с фосфоламбаном (фосфоламбанкиназой), а другой –  цитоплазматической цАМФ-зависимой протеинкиназой ^2,12.  При этом в нативном СР сердца фосфоламбан в дефосфорилированном состоянии действует как ингибитор Са²⁺-насоса, а фосфорилирование фосфоламбана необходимо для снятия ингибирования. В аспекте таких представлений резкое снижение поглощения Са²⁺  суммарной фракцией СР при Там может быть связано с утерей «свободным» СР способности к Са²⁺ кальмодулин- и цАМФ-зависимым фосфорилированиям.  К такому выводу позволяют прийти и ранее полученные данные по действию трифторперазина и термостабильного белка-ингибитора цАМФ-зависимой протеинкиназы на поглощение Са²⁺ СР, указывающие на низкий уровень фосфорилирования СР миокарда кроликов с ТАМ ¹³.

Что касается нарушения фосфорилирования фосфоламбана при ТАМ, то одной из причин этого явления могло бы быть уменьшение содержания в мембранах СР эндогенного кальмодулина, что имело бы ключевое значение в нарушении транспорта Са²⁺, так как для активирования цАМФ-зависимого транспорта Са²⁺ необходимо предварительное фосфорилирование участка фосфоламбана, катализируемого Са²⁺-кальмодулин-зависимой протеинкиназой ^2,13. Однако наши данные об отсутствии фосфорилирования комплекса фосфоламбан – эндогенная Са²⁺-кальмодулин-зависимая протеинкиназа при добавлении экзогенного кальмодулина при ТАМ указывают на несостоятельность такого предполжения.

Нельзя объяснить нарушение фосфорилирования СР при ТАМ и изменением белкового состава мембран, так как он не отличается от нормы. Возможно, причиной возникновения этого явления может быть нарушение образования полифосфоинозитидов во время реакции фосфорилирования ¹⁴, так как было показано, что уровень фосфорилирования очищенного фосфоламбана (лишенного фосфолипидов) намного ниже, чем фосфоламбана в структуре везикул СР, и что добавление к очищенному препарату фосфоламбана фосфотидилинозитола  восстанавливает уровень его фосфорилирования  ^3,4.

снижение уровня фосфорилирования фосфоламбана при ТАМ может происходить из-за изменения фосфолипидного микроокружения фосфоламбана, что вызывает конформационные изменения, которые могут играть ключевую роль в фосфорилировании фосфоламбана и во взаимодействии последнего с Са²⁺ -насосом ^12,14.

Наши данные по фосфорилированию субфракций СР в норме подтверждают гипотезу Gasser et al. ¹⁵, что разные отделы ретикулума находятся под контролем различных регуляторных систем. Они свидетельствуют, что цАМФ-зависимое фосфорилирование наблюдается только в  продолговатых трубочках, а кальмодулин-зависимое – в терминальных цистернах, и это несмотря на присутствии эндогенной кальмодулин-зависимой протеинкиназы во всех субфракциях ретикулума. Аналогичные данные были получены нами и в экспериментах на собаках ¹⁶.  

Так как при ТАМ фосфорилирование «контактного» СР под влиянием кальмодулина не претерпевает существенных изменений по сравнению с нормой, а фосфорилирование «свободного» СР достоверно снижается, то можно сделать вывод, что снижение фосфорилирования суммарной фракции СР миокарда и отсутствие кальмодулин- и цАМФ-зависимого фосфорилирования при ТАМ обусловлены исключительно нарушением фосфорилирования «свободного» СР.Тот факт, что при ТАМ «контактный» СР подвергается кальмодулин-зависимому фосфорилированию, тогда как суммарный препарат СР под воздействием кальмодулина не фосфорилируется, предположительно можно объяснить потерей мембранами в процессе субфракционирования СР ингибиторов протеинкиназ или протеинфосфотаз, дефосфорилирующих СР.